由Scarlett Johansson飾演的第一代「黑寡婦」，本名Natasha Romanoff或Natalia Alianovna Romanova，於《復仇者聯盟4：終極之戰》光榮戰死一幕深深烙印在每位觀眾腦海。她是復仇者聯盟創始成員、第一位女性復仇者、神盾局成員，也是KGB的間諜和刺客。憑藉高超的間諜技能和戰鬥技巧，她成為媲美超級英雄的存在，與惡勢力鬥得難分難解。

Natasha的背景有三個版本。第一個版本她是戰爭孤兒，母親在斯大林格勒戰役中陣亡，使她成為孤兒。一個名為Ivan Petrovitch的男人救了她，往後成為她的義父，也把她訓練成一個忠於蘇聯的士兵。另一版本中，她於1941 年被The Hand 綁架，後者想將她訓練成一名出色刺客，最後被盧根（狼人）、史蒂芬·羅傑斯（美國隊長）及Ivan Petrovitch救出。在第三個版本中，她小時候被斯大林本人錄取參加黑寡婦計劃，並在臭名昭著的間諜學院「紅屋」（Red Room，即她第一次見到冬日戰士的地方）接受訓練。

Natasha在紅屋接受武術、間諜、槍械和體能方面的訓練。KGB安排她下嫁蘇聯空軍英雄飛行員Alexei Shostakov，後者不久去世。丈夫的死令她徹底冷血，她繼續從紅屋畢業，並成為有史以來最好的「黑寡婦」。作為畢業典禮的一部分，Natasha接受了絕育手術。KGB為她送上標誌性的全黑皮革戰衣，並送她一款戴在手腕上的手鐲狀武器Widow's Bite。

由Florence Pugh飾演的Yelena Belova，在Natasha Romanoff叛逃到美國後，接任成為第二代黑寡婦。她和Natasha一同在紅屋接受訓練，並打破了Natasha的各項記錄。後來她的導師Pyotr Vasilievich Starkovsky被謀殺，使她立定心志繼任第二代黑寡婦。

Yelena Belova於 1999 年 3 月出版的《Inhumans》第5期中以次要角色初次登場。儘管她在《黑寡婦》預告片中以「姐姐」稱呼Natasha，但兩人在漫畫中的關係並非姐妹。Yelena視Natasha為必須剷除的叛徒，導致兩人長期的死對頭關係，有時並肩作戰，但更多時互相爭鬥。Natasha曾努力勸她棄暗投明，Yelena亦一度被神盾局招募，但後來又加入九頭蛇，身心都經歷了許多變化。電影中Yelena和Natasha似乎有許多姐妹戲份，看來是重要角色，也許Yelena會成為MCU的新任黑寡婦，像Sam Wilson繼任美國隊長。

漫畫中的Melina是Natasha的死敵。她也是蘇聯間諜訓練計劃的產物，是一名出色的間諜特工、刺客和戰士。她厭倦了活在Natasha的陰影下，順理成章視她為眼中釘。離開了KGB後，Melina成了一名全職罪犯和僱傭殺手，並且將自己包裹在一套靈活的金屬服中，成了Iron Maiden。後來Iron Maiden加入了名為 Femizons 的女性專屬惡棍組織，並與美國隊長對抗。在電影中，她的角色與Natasha有種介乎母女的關係。

Thaddeus “Thunderbolt” Ross將軍是漫威漫畫和MCU的著名配角之一，最著名的功績包括在《變形俠醫》裡試圖拙劣地捕捉變形俠醫並因而創造了惡煞（Abomination），以及後來成為變形俠醫女友的爸爸。在《美國隊長：內戰》中他擔任過美國國務卿。他出身於軍人家庭，曾任空軍上將。他負責軍方的「伽瑪彈」項目，意外導致變形俠醫的誕生。在漫畫中，他後來自己也變了紅變形俠醫（Red Hulk）。

漫威漫畫中較鮮為人知的反派之一，作為黑寡婦的主要反派，今次是他初登大銀幕。 Anthony “Tony” Masters又名 Taskmaster，於 1980 年被引入為復仇者聯盟的對手。他是格鬥技巧的大師。在紐約布朗克斯長大的他，先天有一種特殊的學習能力，只需觀察別人一次動作，他就能完美複制，故此他通過在電視上觀察超級英雄的動作，便掌握了美國隊長、蜘蛛俠、夜魔俠、鐵拳等人的戰鬥技巧，還能永久保存這些記憶。這個「攝影反應」能力還讓他輕易模仿別人的聲音，以及一瞬就學會一種新語言。通常他會攜帶盾牌、弓箭、槍和劍作為他的武器。復仇者跟他對打，就像跟自己的鏡像戰鬥一樣，非常bug。

Dreykov是擁有最少背景故事的角色，因為他是專為MCU電影而創作的，在漫威漫畫中並不存在。在第一部復仇者聯盟電影中，洛基稱Natasha為「Dreykov的女兒」，他的存在才首度被提及。顯然 Dreykov 負責監督紅屋計劃，但他在在電影中有何發揮仍有待觀察。